FDA注冊號：
3010704506
利用大腸桿菌檢驗離心機的檢測方法
發布時間：
2014-01-24
概要：
微生物學中細菌的檢驗往往需要一周時間，其結果對臨床和藥品生產已無太大意義，尤其在藥品半成品檢驗中更不能適應藥品生產的要求。雖有改進方法的報道，但仍脫離不了傳統檢驗方法，且專屬性、靈敏度差。現根據抗原抗體特異性結合的原理及實際經驗，試用大腸桿菌抗血清檢測大腸桿菌抗原獲得成功。
1 實驗部分
1.1 設備與材料
健康新西蘭大耳白家兔(第一軍醫大學動物實驗中心)。大腸桿菌(44102-15，衛生部藥品生物制品檢定所)；臨床分離大腸桿菌菌株(南方醫院檢驗科)。UV-265紫外分光光度計；搖床恒溫水浴箱、盧湘儀大腸桿菌檢驗離心機、震蕩器、滅菌大試管、毛細管、玻片、注射器管。0.5%石炭酸溶液、硫柳汞溶液、飽和硫酸胺溶液、磷酸鹽緩沖液、鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液等。實驗用材料均需滅菌處理。
1.2 方法與結果
1.2.1 大腸桿菌抗原的制備 取5 ml石炭酸生理鹽水，注入經24 h培養的大腸桿菌斜面，洗下菌苔并移至無菌三角錐瓶中，于60℃搖床恒溫水浴箱中放置4 h，取出，搖勻。比濁法、平皿法同時計數，用石炭酸生理鹽水稀釋至9×109個/ml再放入60℃水浴箱中1～1.5 h，取少許做無菌實驗，其余菌懸液放冰箱保存。
1.2.2 大腸桿菌抗血清的制備 取無菌檢查合格的菌懸液，按表1所示［1］，經兔耳靜脈注射，并按表2經兔耳靜脈取血清1 ml，利用盧湘儀大腸桿菌檢驗離心機進行分離，用玻片法測定效價，結果第14日效價最高為1∶5120，經兔動脈取第14日血［2］制成最大斜面，冰箱中過夜，收集血清，加硫柳汞液約2.5 ml/30 ml血清。
表1 大腸桿菌抗原注射劑量時間表
Table 1 Schedule of injection time and dosage of Antigen of E.C.bacilus
Time Dosage (ml) Avoirdupois of rabbit (kg)
One day 0.2 1.8
Two day 0.4 2.0
Four day 0.6 1.9
Six day 2.0 2.0
1.2.3 抗血清保存實驗 取大腸桿菌抗血清原液及稀釋液置冰箱中，于不同時間測定效價，結果抗血清至少可保存50 d(表2)。
表2 保存時間實驗
Table 2 Test of time antiserum kept
Efficiency of
antiserum Firmly extent
10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d
1∶5120 +++ +++ +++ +++ +++ +++
1∶2560 +++ +++ +++ +++ +++ +++
1∶1280 +++ +++ +++ +++ +++ +++
1∶640 +++ +++ +++ +++ ++ ++
1∶320 +++ +++ ++ ++ + -
+++、++表示玻片法、試管法均形成牢固凝膠；+表示玻片法凝膠牢固，試管法不牢固；-表示玻片法、試管法均不凝固
1.2.4 混合抗血清的制備 取大腸桿菌(44105-15)與臨床、藥物分離菌株制備混合抗原和混合抗血清，結果混合抗血清的效價為1∶4 800。
1.3 大腸桿菌原檢測
1.3.1 檢測已知抗原 取大楊桿菌(44102-15)1株，臨床分離菌株5株，藥物分離菌株4株及藥物污染大腸桿菌(44102-15)后分離菌株5例，用玻片法以1∶320效價的抗血清檢測，結果全部陽性(陽性、陰性對照均成立，陰性用滅活的葡萄球菌，沙門氏菌)。
1.3.2 檢測未知抗原 將受檢藥品和臨床標本經24 h培養的肉湯增菌液和盧湘儀離心機直接分離(10 000 r/min)的樣品液分別與混合抗血清進行實驗，結果與傳統法一致(表3)。
表3 樣品測定結果
Table 3 Result of sample checked
Sample(share) This method Traditional method
+ - + -
SP of cell(12) 1 11 1 11
LP of sell(6) 0 6 0 6
SP of self-product(36) 2 34 2 34
LP of self-product(25) 3 22 3 22
Clinic sample(3) 2 1 2 1
SP=Solid preparation；LP＝Liquid preparation
2 討論
2.1 抗原抗體凝集為一特異、靈敏的方法需要制備多種抗原族的抗體才能滿足不同抗原的要求，用混合抗體檢測不同抗原族的大腸桿菌基本可滿足日常工作需要，達到快速、準確。對于單抗原細菌，則只需制備相應抗原的抗體即可。
2.2 混合抗體的制備需要適當選擇抗原族，以免制成的混合抗體不能檢出規定的細菌而造成漏檢。
2.3 文中方法制備抗原須滅活細菌，抗體制備須研究抗原的注射劑量、注射時間和取血時間，避免抗原制備失敗或抗體效價不理想。且所需細菌樣品要求不嚴格，用離心沉降集菌法或增菌培養均不影響檢驗的靈敏度和準確性。
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