高速離心機快速提取組織/細胞RNA的實驗步驟

發布時間：

2014-10-27

概要：

將勻漿后裂解物13，000rpm離心3分鐘,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物, 將裂解物上清小心轉到一個新離心管。

提示：
? 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量無水乙醇!
? 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的RLT 4℃可放置一個月。

1. 組織培養細胞
a. 收集<107懸浮細胞到一個1.5ml離心管，對于貼壁細胞，孔板培養可以直接裂解，細胞瓶培養應該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。

b. 13，000rpm離心10秒（或者300g離心5分鐘），使細胞沉淀下來。完全吸棄上清，留下細胞團，注意不完全棄上清會稀釋裂解液導致產量純度降低。

c. 輕彈管壁將細胞沉淀完全松散重懸，加入350μl（<5x106細胞）或者600μl（5x106-1x107細胞）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

d. 用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產量。

e. 接操作步驟項下3。

2. 動物組織（例如鼠肝腦）
a. 電動勻漿：新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,加入350μl(<20mg組織)或者600μl(20-30mg組織)的裂解液RLT后電動徹底勻漿20-40秒。

b. 液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細粉后，取適量組織細粉(20mg/30mg)轉入裝有350μl/600μl組織裂解液RLT的1.5ml離心管中, 用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產量。

c. 將勻漿后裂解物13，000rpm離心3分鐘,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物, 將裂解物上清小心轉到一個新離心管。

d. 接操作步驟項下3。

3. 較精確估計裂解物(上清)體積,加入等體積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

4. 立刻將混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心60秒，棄掉廢液。

5. 加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12，000rpm 離心30秒，棄掉廢液。如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。

6. 加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復一遍。

7. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

8. 取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產量），室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

9. 如果預期RNA產量>30μg,加30-50μl RNase free water重復步驟8, 合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇。

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