提取動(dòng)物組織細(xì)胞DNA基因組的方法

發(fā)布時(shí)間：

2014-03-03

概要：

恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）

一、實(shí)驗(yàn)原理
真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來(lái)制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細(xì)胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來(lái)。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）

三、操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見(jiàn)組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見(jiàn)絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）
3.加等量的酚：氯仿：異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測(cè)濃度和純度。
四、常見(jiàn)問(wèn)題
1.選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)。
2.在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA團(tuán)塊形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^(guò)大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。
4. 電泳檢測(cè)時(shí)DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入SDS至終濃度為0.5%，并重復(fù)步驟2～8。
6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。

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